Универсальный логический оценщик РНК, оперирующий в клетках млекопитающих

Молекулярный автомат – сконструированная молекулярная система, соединенная с биомолекулярной средой посредством «потока получаемых сообщений и действий исходящих сообщений», где получаемые сообщения обрабатываются «промежуточным набором элементов», то есть компьютером.

 Молекулярные автоматы могут имплементировать разнообразные модели вычислений (цифровые и аналоговые схемы, сети нервной системы) для исполнения множества заданий. Дизайн, рассматриваемого примера является многоцелевым. Но перед тем как приступить к рассмотрению этого устройства, проведем еще один небольшой экскурс в биологические термины.

Белок – (протеин) – высокомолекулярное органическоеие вещество, состоящее из соединенных в цепочку аминокислот. В живых организмах аминокислотный состав белков определяется генетическим кодом.

RNA - (РНК – рибонуклеиновые кислоты) – высокомолекулярные органические соединения, принимает решающие участие при трансляции, т.е. финальной реакцией реализации генетической информации в белках.

Центральная догма молекулярной биологии – эмпирическое правило реализации генетической информации: информация передается от RNA к белку, но не в обратном направлении. Переход генетической информации DNA (ДНК) -> RNA -> Белок, является универсальным для всех, без исключения, клеточных организмов.

Тоесть RNA является неким дешифратором для реализации информации, записаной в DNA (памяти) в белках.

RNAi – (РНК интерференция) специфический процес ингибирования, т.е. замедления или предотвращения течения различных химических реакций в молекуле RNA . Результатом является, как бы нокаут гена, с которого данная RNA считывается. И синтез соответствующего белка блокируется.

Если пояснить на пальцах, то RNAi это выключение или изменение нужной ячейки памяти.

Более подробно об процесе RNAi, можно прочесть в приложении А. Теперь, рассмотрев все необходимые термины, которые вызывают дикий ужас у любого человека с техническим образованием, вернемся к чудо-машине. Итак, на пути от гена к белку находится молекула матричной РНК (мРНК), по которой и ведется синтез белка (трансляция). Механизмом, способным отменить трансляцию, является РНК-интерференция . Механизм запускается, когда в клетке появляются малые интерферирующие РНК. Оказавшись в клетке, одна из нитей siRNA связывается с белковым комплексом RISC (RNA-induced silencing complex). Этот комплекс находит мРНК, которая содержит определенную последовательность – мишень siRNA, и разрезает ее в определенном месте (сайте), последовательность нуклеотидов в котором комплементарна нити siRNA. Результатом этого является уменьшение или, при достаточном количестве siRNA, полное прекращение синтеза соответствующего белка.
Поэтому, если в последовательности нуклеотидов, кодирующие один и тот же флуоресцентный белок, вставить сайты-мишени для siRNA, мы сможем получать этот флуоресцентный белок или его отсутствие в зависимости от того, не связалась или связалась siRNA со своей мишенью на мРНК этого белка. А активность siRNA регулируется состоянием логического молекулярного «входа»: наличием или отсутствием блокирующей или активирующей siRNA молекулы. Вот вам и биокомпьютер! Хотя данная разработка предполагает отдельные сенсорные и вычислительные модули, тут демонстрируется только вычислительный модуль. 

Существует несколько теоретически эквивалентных, но практически разных, способа ответить на случайные логические вопросы. Они обычно касаются разбивки сложного составного вопроса в иерархическую систему более простых вопросов.

1.)      Один из вариантов – быть очень точным с основными модулями (например, первые исходные данные должны быть верными, а вторые – ложными). Однако, надо соединять эти модули в менее строгом порядке, когда итоговый положительный результат достигается путем позитивного ответа на один из модулей. Это ни что иное, как DNF – операция ИЛИ, применяемая к выражениям (операторам), состоящим только из операций И и их отрицаний (НЕ) с булевыми переменными.

 

2.)      Второй способ – быть менее строгими с основными модулями (например, по меньшей мере один из вводов имеющихся данных должен касаться ожидаемого состояния), но строго оценивать комбинации модулей, настаивая на том, чтобы все ответы были положительными синхронно, чтобы получить итоговый положительный ответ. CNF – это операция И над операторами, содержащими только дизъюнкцию (ИЛИ) и литералы (НЕ)

 

2.2 Устройство молекулярного автомата для ДНФ выражений

 

 

Чтобы сконструировать вычислительную программу, вмещающую в себя принципы первого подхода, разработана биологическая «цепь», которая состоит из двух или больше видов RNA, которые кодируют один и тот же протеин, но имеют разные некодированные участки. Этот протеин – итог системы, шина вывода, если так будет понятнее. Рассмотрим предлагаемые схемы (рис. 2-1).

a –схема, иллюстрирующая операцию ИЛИ между молекулами мРНК. В таблице истинности стрелки вверх указывают на присутствие мРНК.
b –схема, описывающая операцию И между молекулярными входами А и B. Фигурки из точек – молекулы или события A и B, блокирующие siRNA при взаимодействии с ними. В таблице истинности стрелки вверх обозначают наличие веществ A и B и белка ZsYellow на выходе как результата конъюнкции.
c – схема, соответствующая логическому отрицанию (операция НЕ) молекулярного входа А, и таблица истинности. Здесь фигурка из точек обозначает активацию siRNA событием (наличием вещества) А.
d – схема генной DNF-сети. Молекулярные входы – точечные линии и фигурки (A, B, C, E). CMV – последовательность для старта производства белка.

 

Рисунок 2-1 - Дизайн генной сети молекулярного компьютера на основе DNF-формы

Если присмотреться, то такое расположение переменных ввода и их отрицания (константы) не что иное, как дизъюнктивная нормальная форма (ДНФ). Константы, сгруппированные операцией И, называются условиями. Виды mRNA, а также гены, которые их отображают – «молекулы условий».Теперь еще раз вспомним необходимые понятия:

mRNA – ( м РНК – информационная РНК) – РНК, отвечающая за перенос информации о структуре белков от DNA к местам синтеза белков. mRNA синтезируется на основе DNA , в ходе копирования генетического кода с DNA к mRNA .

siRNA – (small interfering Ribo Nucleic Acids) молекулы RNA, отвечающие за RNAi. То есть за блокирование тех генов, которые соответствуют одной из цепочек внутри RNAi

1.)      Биологически активный итог (флуресцентный белок) может функционировать как силовой привод. Если по меньшей мере одна из mRNA перемещена, то итог будет отображать логическую истину, вводя операцию ИЛИ. Уровни видов mRNA и итог зависят от присутствия или отсутствия эндогенных молекулярных начальных данных, формирую своего рода таблицу истинности. Молекулы siRNA нацелены на неперемещенные участки и, следовательно, являются природными кандидатами для этого посредничества. Это значит, что если хотя бы одна мРНК транслирована, то результатом молекулярной схемы, описывающей логическую операцию ИЛИ, будет значение ИСТИНА (рис.2-1a).

2.)      Для реализации функции И, в начале, разные наборы siRNA объединяют в три неперемещенных региона (UTR- untranslated regions) mRNA, считая их восприимчивыми к этим siRNA. Далее обеспечивают выборочные препятствующие связи между эндогенными первоначальными данными и siRNA. Все данные должны присутствовать в одно и то же время, чтобы заблокировать все siRNA и сгенерировать исходные данные mRNA, в соответствии с логической операцией И (Схема 2-1b). То есть, в схеме, UTR мРНК, кодирующей «выходной» белок, мишени для siRNA-A и siRNA-B вставили последовательно. В этой ситуации предполагается, что входные молекулы A и B блокируют соответствующие siRNA. Поэтому, чтобы генерировать выход с мРНК, обе молекулы A и B должны присутствовать одновременно (рис.1b).
UTR область - нетранслируемая область мРНК – последовательность, расположенная после сигнала остановки синтеза белка. Этот участок не кодирует аминокислот, но определяет, в частности, будет ли с данной мРНК производиться белок или она будет уничтожена при определенных условиях.

 

3.)      Если же устанавливается активизирующая связь, то наличие или отсутствие входных данных заблокирует или позволит ответ от mRNA (логическая операция значения истины) (рис. 2-1с).

4.)      Пример генной DNF-сети показан на рис.2-1d.

Молекулярный оператор 1 – мРНК флуоресцентного белка ZsYellow с мишенями для siRNA-A, siRNA-C и siRNA-E в UTR участках (мРНК1).

Молекулярный оператор 2 – мРНК того же белка, только UTR область содержит мишени для siRNA-НЕ(А) и siRNA-B (мРНК2).
Если, к примеру, A, C и E присутствуют, то соответствующие siRNA будут блокированы и трансляция светящегося белка будет идти с мРНК1. Хотя siRNA-НЕ(A) будет активной и подавит трансляцию белка ZsYellow с мРНК2, общий результат операции (мРНК1) ИЛИ (мРНК2) будет оценен как ИСТИНА.

 

 

2.3 Устройство молекулярного автомата для КНФ выражений

 

 

Биологическая цепь, которая предполагает только второй подход, включает в себя виды mRNA, которые производят фактор считывания информации, подавляющий кодирующий выходные данные ген. Принцип основан на использовании молекул мРНК, кодирующих белки-репрессоры LacI и LacI-KRAB (рис.2-2).

Репрессоры – это белки, которые, связываясь со своей мишенью на ДНК в промоторно-операторной области (месте старта синтеза мРНК), препятствуют образованию мРНК.

Репрессор LacI выделен из бактерии E.сoli, a KRAB – из клеток человека. Связывание LacI (или LacI-KRAB) репрессора с операторной областью LacO, расположенной перед геном, кодирующим выходной белок (здесь – dsRed), препятствует образованию его мРНК и, следовательно, самого белка (в данном случае флуоресцирующего красным белка dsRed). Рассмотрим, предлагаемые ниже, схемы (рис. 2-2).

a – схема, иллюстрирующая операцию И между двумя молекулами мРНК. Стрелка вниз в таблице истинности указывает на отсутствие мРНК. CAG – последовательность, кодирующая сигнал старта для синтеза продукта. LacO – мишень для репрессоров LacI и LacI-KRAB.
b – схема, описывающая операцию ИЛИ между молекулярными входами А и B.
c – схема, соответствующая логическому отрицанию (операции НЕ) молекулярного входа А.
d – схема генной CNF-сети. Молекулярные входы – точечные линии и фигурки (A, B, C, E). CMV и CAG – промоторы (последовательности старта производства белка).

Рис. 2-2 - Дизайн генной сети молекулярного компьютера на основе СNF-формы

1.)      Если репрессор эффективно регулирует выходные данные, все mRNA должны быть устранены, чтобы сгенерировать выходные данные, имплементируя логическую операцию И (таблица 2-2а). Если репрессор с одной мРНК эффективно блокирует белок dsRed , то для получения последнего на выходе необходимо, чтобы все мРНК, производящие репрессор, были удалены, что соответствует логической операции И (рис.2-2a).
 

2.) Как и до этого, мы комбинируем комплекты целей siRNA. Однако, в отличие от прошлого случая, эндогенные входные данные должны активизировать siRNA, а не заблокировать их. ПО меньшей мере одна siRNA из каждого комплекта должна быть активизирована, чтобы устранить все репрессоры mRNA и деблокировать подавление, в соответствии с логической операцией ИЛИ (рис. 2-2б). Как и в схеме с DNF, последовательности-мишени для siRNA вставили в 3’-UTR участки мРНК, кодирующих репрессоры. Но, в противоположность предыдущей схеме, здесь предполагается, что молекулы на входе активируют siRNA, а не блокируют их. Хотя бы одна из двух siRNA, нацеленных на одну мРНК, должна быть активирована, чтобы уничтожить эту репрессорную мРНК (рис. 2-2b). Это приведет к освобождению LacO области от LacI и, соответственно, инициирует образование белка dsRed. Эта ситуация иллюстрирует логическую операцию ИЛИ (рис.2-2b).

3.)  Например, если А и B активизируют siRNA, направленные на одну mRNA, а Х и Y активизируют siRNA, направленную на другую mRNA, как минимум A или B, а также X или Y должны присутствовать (A ИЛИ B; X ИЛИ Y). Данные, блокирующие медиатора- siRNA отсутствуют в выражении (рис. 2-2с). Это – пример выражения конъюнктивной нормальной формы (КНФ) – (рис. 2-2д). Стандартные формы ДНФ и КНФ особенно полезны, потому что любое логическое условие может быть оценено с использованием соответствующей ДНФ или КНФ. В случае с логическим отрицанием (рис.2c) предполагается, что молекулярный вход А блокирует siRNA. В этом случае, если А нет на входе (ЛОЖЬ – FALSE), тогда нет репрессора и есть белок dsRed, что соответствует операции НЕ (А), и на выходе мы имеем ИСТИНУ – TRUE.

 

Пример генной CNF-сети показан на рис.2-2d. Если молекулярные входы B и С присутствуют, тогда активируются siRNA-B и siRNA-C, снижая количества репрессора LacI, синтезируемого с молекул-операторов мРНК1 и мРНК2. При этом общий уровень белка LacI будет низким, что приведет к освобождению области LacO от LacI. Теперь участок старта синтеза белка dsRed открыт и на выходе имеем большие количества белка dsRed, что соответствует результату ИСТИНА.
Экспериментально эти генные схемы были реализованы в культурах клеток человеческих эмбриональных почек (293-Н). В эти клетки одновременно вводили гены, соответствующие используемой логической форме – DNF (рис.1d) или CNF (рис.1b,d), и имитировали действие входных сигналов добавлением или отсутствием соответствующих молекул siRNA. Выходные сигналы в виде количества соответствующих белков анализировали через 48 часов. Молекулы siRNA и их мишени сконструировали на основе известных последовательностей – T1 и T2 из морского кораллового полипа Renilla reniformis, FF3 и FF4 – из люцифераз светлячков и S14 из eGFP – зеленого флуоресцентного белка медузы.
флуоресцентного протеина).

 

 

2.4 Тестирование индивидуальных молекул

 

 

Далее проводились оценивающие эксперименты для выражение ДНФ и КНФ. Были сконструировали цепи, чтобы оценить два выражения в форме ДНФ. Так, для двух генных сетей, соответствующих двум DNF-формам, были просчитаны все варианты пяти входных переменных (табл.2-3а).

                   

Рисунок 2-3 - Таблицы истинности для вычисляемых выражений

Форме D1 – (A И B И C ) ИЛИ (D И E) – соответствуют два молекулярных оператора. Один из них содержит в нетранслируемом конце гена ZsYellow последовательные мишени для siRNA, блокирующих синтез белков T1 (A), T2 (B) и S14 (C). В тот же участок второго гена-оператора встроены мишени для siRNA FF3 (D) и FF4 (E) (в соответствии с рис. 2-1d).
Форме D2 – (A И C И E) ИЛИ (НЕ(A) И B) – соответствуют молекулярный оператор 1, содержащий в нетранслируемом конце гена ZsYellow последовательные мишени для siRNA, блокирующих синтез белков FF4 (A), T1 (C) и S14 (E), и молекулярный оператор 2, содержащий мишени для siRNA, блокирующих синтез FF3 (НЕ(A)) и T2 (B) в том же участке (в соответствии с рис.2-1d).
Та же siRNA (FF3) была по-разному использована в D1 и D2, один раз как переменная Е, а второй – как отрицаемая переменная НЕ(А). После прогонки всех возможных истинных значений для переменных в каждом выражении: 32 для D1, 16 для D2 (рис. 2-3а), распределение групп выходных данных продемонстрировало четкое разграничение между группами истинных и ложных данных. Оценивание выражения D1, когда все переменные истинны, а siRNA не присутствуют, привело к увеличению выходных данных более, чем в 2 раза. Высокое значение данных интерпретировано как истинное. Несмотря на то, что в выражении D2 было получено одно несовершенное оценивание ложности (A:T, B:F, C:F, E:T), увеличение количества siRNA SI4 от 2.5 pmol до 10 pmol, привело к улучшении подавления до 0.08 единиц.
Интенсивности флюоресценции (цифры справа от фотографий) соответствуют количеству синтезируемых выходных белков и показывают явное различие между группами «ЛОЖЬ» и «ИСТИНА» (в среднем в 16 раз), как и требуется в логическом выражении. В случае со всеми значениями переменных «ИСТИНА» в D1 (когда нет ни одной siRNA) количество выходного белка более чем вдвое превышало остальные положительные результаты, что отражало параллельный выход белков с обеих операторных мРНК.

Рисунок 2-4 - Тестирование индивидуальных молекул ДНК

а – результаты оценки двух DNF-выражений, полученные для всех комбинаций переменных.
Когда на входе siRNA имеют значения «–» (т.е. отсутствуют), то для одинакового общего количества siRNA во всех экспериментах в качестве негативного контроля использовали соответствующее количество нонсенсной siRNA (не имеющей здесь мишени). Цифры справа показывают суммарную интенсивность флуоресценции белка Zsyellow (зеленого цвета), отнесенную к интенсивности флуоресценции контрольного белка pAmCyan (красного цвета). Совместная экспрессия белков Zsyellow и pAmCyan дает сигналы от красного (при низкой экспрессии ZsYellow) до зеленого или желтого (при достаточно больших количествах ZsYellow).
b – оценка двух CNF-форм.
   В форме C1 (D ИЛИ E) использовали молекулу-оператор CMV-LacI-FF3-FF4, содержащую мишени для siRNA FF3(D) и FF4(E), и регулируемый этой конструкцией белок dsRed в т.н. репортерной молекуле CAGOP-dsRed. Значения «ИСТИНА» отличаются от результатов «ЛОЖЬ» в форме C1 более чем в 3 раза. По сравнению с генной схемой DNF CNF-форма С1 работает не так эффективно (там количество репортерного белка различается в 16 раз). Поэтому авторы попытались увеличить разницу между «ИСТИНОЙ» и «ЛОЖЬЮ», действуя «на два фронта».
Чтобы сильнее подавить выработку репортерного белка dsRed, они взяли более сильный репрессор – LacI-KRAB, а в молекулу-оператор вставили вместо одной три последовательных мишени для siRNA FF3 и FF4: CMV-LacI-KRAB-FF3*3-FF4*3. Ожидалось, что утроение числа мишеней для репрессорных siRNA и усиленное подавление синтеза репортерного белка более активным репрессором заметно увеличат разницу между результатами, но это привело лишь к двукратному улучшению (разница в 6 раз).
В форме C2 авторы смоделировали операцию И – (D) И (E) (рис.2-2d): молекула-оператор CMV-LacI-FF3*3 с тремя мишенями для siRNA FF3 (D), молекула-оператор CMV-LacI-FF4*3 с тремя мишенями для siRNA FF4 (E) и репортерная молекула CAGOP-dsRed.
С2 принимает значение ИСТИНА только тогда, когда синтез репрессоров на обеих мРНК подавлен, т.е. когда присутствуют обе siRNA (FF3 и FF4) (рис. 2-2d и рис.2-3b). Здесь также разница между ИСТИНОЙ и ЛОЖЬЮ не очень велика (3 раза), но достоверна.

 

 

ВЫВОДЫ

 

 

Таким образом, авторы показали, что биокомпьютер, основанный на генных логических схемах, встроенных в человеческие клетки, дает достоверные результаты в ответ на возможные значения пяти молекулярных переменных.
Такие биокомпьютеры, анализирующие входные данные в виде наличия или отсутствия в среде определенных биологических молекул и в качестве сигналов на выходе синтезирующие другие, легко определяемые соединения (в данном случае – фуоресцирующие белки), могут «логически» контролировать биологические процессы в живом организме.
Применение биокомпьютеров в перспективе может быть самым широким – в фундаментальных науках, в фармакологии (для оценки влияния потенциальных лекарственных препаратов на человеческие клетки в культуре) и в медицине – для диагностики различных болезней.
Этот доклад представляет собой шаг по направлению к пониманию функционирования программируемого принимающего решения молекулярного автомата, дающего расчетную основу, которая оценивает логические выражения в стандартных формах. Эти формы, оцениваемые с помощью двухуровневых логических цепей, могут вызвать экспоненциальное увеличение размера для представления определенных логических функций, относящихся к многоуровневым цепям. Однако, уменьшение количества стадий расчета уменьшает общее время обработки цепи. Шум и деградация сигналов – важная тема для обоих типов цепей. Восстановление сигналов, то есть улучшение отношения ВКЛ\ВЫКЛ на промежуточных стадиях увеличивает масштабируемость и действие. Возможно также разделить процесс вычисления на иерархические группы и ввести единое восстановление. На данный момент работа цепей сравнима с логическими сетями, не использующими процесс восстановления.

ПЕРЕЧЕНЬ ИСТОЧНИКОВ

 

1. http://www.nature.com/nbt/journal/v25/n7/full/nbt1307.html#B2 – статья «A universal RNAi-based logic evaluator that operates in mammalian cells»;

2.http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%97%D0%B0%D0%B3%D0%BB%D0%B0%D0%B2%D0%BD%D0%B0%D1%8F_%D1%81%D1%82%D1%80%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D1%86%D0%B0 – Основные термаины молекулярной биологии

3. http://americanhistory.si.edu/collections/comphist/montic/cray.htm#cr17 – воспоминания Мистера Крэя;

4. http://www.genoterra.ru/news/view/18/776 - приложение А;

5. http://www.cellbiol.ru/REVIEW/MolBiol/regulation/RNAi.shtml - приложение А;

Вспомогательные источники:

6. http://www.nature.com/index.html

7. http://www.biotechnolog.ru/

8. http://www.in1.com.ua/article/972/index.html

9. http://works.tarefer.ru/64/100521/index.html

10. http://www.galactic.org.ua/Prostranstv/gen_nov-1.htm

 

 

Приложение А

ФЕНОМЕН МАЛЫХ РНК. РНК ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ

 

 

Первое показание RNAi было извлечено исследователями, когда они пытались создать более красочные цветы, вводя дополнительные образцы генов, ответсвенных за пигментацию. Задавшись целью получить сорт петуний, который обладал бы более яркими бордовыми лепестками, генетики ввели в ее клетки ген, отвечающий за синтез красного пигмента. К удивлению ученых, многие цветы, вместо того, чтобы усилить окраску, вовсе теряли пигмент и получались белыми. С этого и других похожих наблюдений, сделанных в начале 90-х годов, и началась история малых РНК.

Рисунок А-1 - Петунии, над которыми проводились эксперементы

В другом эксперименте биологи, изучавшие генетическую регуляцию у одного из самых популярных в последнее время модельных организмов - червя Caenorhabditis elegans ( Ценорабдитис элеганс , или сокращенно C. elegans ), пытались усилить работу определенных генов путем введения в клетки червя дополнительных копий таких генов (в виде ДНК). И снова, вместо усиления выраженности данного гена, ученые наблюдали противоположный эффект: его полное "замолкание". Длительное время никто не мог объяснить происходившие феномены, рассматривая их как артефакты. И лишь спустя годы удалось установить, что во всех подобных случаях в клетках подопытных организмов появлялись большие количества так называемых "малых" РНК. К еще большему удивлению привело исследование структуры таких молекул. Оказалось, что эти РНК являются копией отдельных участков тех самых генов (ДНК), которые вводились в клетку, и активность которых подавлялась.

Снова - загадка. С одной стороны, структура таких малых РНК однозначно говорит о том, что они были скопированы с введенной в клетку ДНК, что для клетки вполне нормально (если не считать подозрительно малую длину этих молекул). С другой стороны - вместо того, чтобы, как большинство "нормальных" информационных РНК, переносить информацию для синтеза белков и способствовать, таким образом, усилению выраженности гена (например, усиливая цвет петуний), эти РНК каким - то образом умудряются проделывать совершенно противоположную работу.

Начиная с 1995 года, исследователи предприняли попытки повторить этот эффект экспериментально. Для этого они искусственно синтезировали небольшие участки РНК, являющиеся почти точной копией участка определенного гена, и вводили их различным организмам.

Первое подтверждение феномена "замолкания" генов было получено все у того же C. elegans. Немного позже это свойство коротких РНК выявили у мух и, наконец, в 2001 году - при введении в клетки мыши и человека. В том же 2001 году Science включил исследования малых РНК в число наиболее важных.

Почему же малые РНК способны выполнять столь необычные функции?

Решение парадокса малых РНК началось с детального изучения их структуры, биологических характеристик и путей их превращения (метаболизма) в клетках различных организмов.

Длительное время биологи просто не обращали особого внимания на короткие отрезки клеточной рибонуклеиновой кислоты (РНК), полагая, что их роль в клетке не слишком значительна. Гораздо больший интерес привлекали другие типы РНК, а именно информационные и рибосомальные. Оба этих класса - очень длинные молекулы, содержащие до 100 000 нуклеотидов. Первые (информационные, которые часто называют также матричными РНК, или мРНК) переносят генетическую информацию с хромосом (ДНК) в специальные органеллы- "агрегаты" для синтеза белков - рибосомы. Второй класс – рибосомальная РНК - является одновременно и строительным материалом, и важнейшей рабочей частью рибосом.

Понятно, что с первого взгляда малые РНК, состоящие всего из нескольких десятков нуклеотидов, могли показаться просто мусором, остатками от своих "больших братьев". И даже несмотря на то, что роль отдельных малых молекул РНК в процессах превращения информационных РНК (сплайсинге), а также при упаковке нитей нуклеиновых кислот, была доказана ранее, истинным "хитом" в биологии малые РНК стали только лишь с открытием своей способности подавлять экспрессию (выраженость) генов у животных.

В нормально работающей клетке каждый ген выполняет собственную, строго определенную функцию, например, отвечает за выработку белка, мРНК, или за взаимодействие с другими регуляторными белками. При этом говорят о нормальной экспрессии (от лат. expressus - выразительный, явный) гена в клетке. Если же количество продукта данного гена (например, белка) снижается, то говорят о снижении экспрессии данного гена. Эффект "гашения" экспрессии определенных генов малыми РНК получил название РНК-интерференции, а молекулы, вызывающие его, назвали siRNA (small interfering RiboNucleic Acids) - малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты;

   С открытием siRNA - интерференции стало ясно, что этот феномен может иметь огромное практическое значение.

Вы спросите как это понимать? Поясним на примере медицины: Существует по крайней мере три способа влияния RNAi на медецинские исследования. Исследователи уже имеют возможность выборочно блокировать активность любого гена, путем создавания генам препятствий – генетических заградительных полос или конструированием мутаций. В червях это очень просто сделать путем изменения информации о снабжении пищей. Черви обычно питаются бактериями и ее достаточно, что заблокировать нужный ген. Эта благоприятная возможность помогла ученым блокировать проявление каждого одинарного гена в геномном ряду червей и таким образом исследовать их влияние на червей.

Вне исследовательских работ RNAi и родственных методик испрользуются в борьбе с болезнями, особенно с раком, который зависит от отклонившихся проявлений некоторых генов. Некоторые терапии уже достигли результатов на стадии ограниченного тестирования на человеке.

 

 

Приложение Б

ПРИЛОЖЕНИЯ РАЗРАБОТЧИКОВ

 

 

Молекулы siRNA (Язык оригинала).

 

 

The sequences of the ribo-oligonucleotides are given in Supplementary Table 1. T1 and T2 siRNAs were annealed from gel-purified oligomers (Proligo); gel-purified SI4 siRNA (Proligo) was used as provided by the manufacturers. FF3 and FF4 siRNAs were annealed from desalted oligomers (Dharmacon) after purification from 20% denaturing PAGE. To anneal RNA oligomers, equimolar amounts (50 or 200 M) of the sense and antisense oligomers were mixed in 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA and 0.5 U/ l Superase-In (Ambion), heated to 95 °C and slowly cooled down to 10 °C in a PCR block for 50 min. The size and purity of the siRNAs were verified using 3.5% Metaphor agarose gel (Cambrex).

 

 

Молекулы siRNA (Технический перевод)

 

 

Последовательности рибо-оглинуклеотидов приведены в дополнительной таблице 1. Т1 и Т2 cиРНКотжигаются из гелевых очищенных олигомеров(Proligo). FF3 и FF4 сиРНА – из опресненных олигомеров (Dharmacon). Для производства олигомеров РНК, еквимолярные количества (50 или 200 моль) олигомеров были смешаны в in 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA и 0.5 U/ l Superase-In (Ambion), нагреты до 95 °C и медленно охлаждены до 10 °C в течении 50 мин. Размер и чистота сиРНК подтверждены, используя 3.5% агарозный гель (Cambrex)

Клеточные культуры (Язык оригинала).

 

 

Serum-free media (SFM) adapted 293-H cells (Invitrogen) were used throughout the experiments. The cells were grown at 37 °C, 100% humidity and 5% CO2. The cells were initially transferred into CD-293 medium and a week later moved to the Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Invitrogen) supplemented with 0.1 mM of MEM nonessential amino acids (Invitrogen), 0.045 units/ml of penicillin and 0.045 g/ml streptomycin (penicillin-streptomycin liquid, Invitrogen), and 10% FBS (Invitrogen). The adherent culture was maintained indefinitely in this medium by trypsinizing with trypsin-EDTA (0.25% trypsin with EDTA Na4, Invitrogen) and diluting in a fresh medium upon reaching 50–90% confluence. For transfection experiments, 90–120 thousand cells in 1 ml of complete medium were plated into each well of 12-well uncoated glass-bottom (MatTek) or plastic (Falcon) plates and grown for 24 h. Shortly before transfection, the medium was replaced with 1 ml DMEM without supplements with a single medium wash step. Transfection mixtures were prepared by mixing all nucleic acids, including the plasmids and the siRNAs into 40 l of DMEM. 2.4 l of the Plus reagent (Invitrogen) was added to the final mix and incubated for 20 min at 24 °C. In parallel, 1.6 l lipofectamine (Invitrogen) were mixed with 40 l DMEM. Plus- and lipofectamine-containing solutions were mixed and incubated for 20 more min at 24 °C before application to the cells. The transfection mixture (typically 90 l) was applied to the wells and mixed with the medium by gentle shaking. Three hours after transfection, 120 l FBS was added to the wells and the cells were incubated for up to 48 h before the analysis.

The cells were prepared for the fluorescent-activated cell sorting (FACS) analysis by trypsinizing each well with 0.5 ml 0.25% trypsin-EDTA, collecting the cell suspension and centrifuging at 2,655 gs for 2 min. Trypsin was removed and the pellet resuspended by short vortexing in 0.5 ml PBS buffer (Invitrogen).

 

Клеточные культуры (Технический перевод)

 

 

Медиатор без сыворотки (SFM) и приспособленный клетки 293-Н (Invitrogen) были использованы в экспериментах. Клетки выращивались при температуре 37 °C, 100% влажности и 5% CO. К клеткам были впоследствии добавлены 0.1 mM несущественных аминокислот, 0.045 единиц\моль пенициллина, 0.045 г/моль стрептомицина и 10% FBS.

Для экспериментов с трансфекцией приблизительно 90-120 тысяч клеток в 1 мл определенной среды выращивались примерно 24 часа. Незадолго до трансфекции, среда заменялась 1 мл DMEM без добавок. Смеси для трансфекции были изготовлены, смешивая все нуклеокислоты, включая плазмиды и сиРНК, с 40 l DMEM. Через 3 часа после трансфекции, добавлялось 120 l FBS, клетки инкубировались до 48 часов перед анализом.

 

Использование микроскопа (Язык оригинала)

 

 

All microscope images were taken from live cells grown in glass-bottom wells in the transfection medium supplemented with 10% FBS. We used the Zeiss Axiovert 200 microscope equipped with Sutter filter wheels, Prior mechanized stage and an environmental chamber (Solent) held at 37 °C during measurements. The images were collected by an Orca ERII camera cooled to -60 °C, in the high precision (14 bit) mode using a 20 PlanApochromat NA 0.8, PH2 objective. The collection setting for the fluorophores in crosstalk measurements and DNF evaluation experiments were S500/20x (excitation) and S535/30m (emission) filters for ZsYellow; and S430/25x (excitation) and S470/30m (emission) for AmCyan. A dichroic mirror 86004v2bs (Chroma) was used for both fluorophores. In CNF evaluation experiments the settings were: S565/55x (excitation) and S650/75m (emission) filters with a dichroic mirror 86021bs (Chroma) for dsRed- monomer, and AmCyan settings as above. For the anticorrelated output experiment we used yellow fluorescent setting as above and S565/25x (excitation) and S650/75m (emission) filters with a dichroic mirror 86007bs (Chroma) for dsRed-monomer. Data collection and processing were performed by the Metamorph 7.0 software (Molecular Devices). After background subtraction, the relative intensities of the internal transfection control and the reporter protein were adjusted to equalize the apparent intensity of both in the negative control experiments. The settings were applied uniformly to all images taken from the crosstalk experiments and DNF evaluations. A different setting was applied to the images taken from the CNF evaluation experiments and to the anticorrelated output experiments because the constructs had a different baseline fluorescence.

 

 

Использование микроскопа (Технический перевод)

 

 

Все образы из микроскопа были взяты, используя живые клетки. Мы использовали микроскопы Zeiss Axiovert 200. Образы были отсняты фотоаппаратом Orca ERII, охлажденной до -60 °C, с большой точностью (14 бит), используя объектив 20 PlanApochromat NA 0.8, PH2. Для ДНФ испоьзовались такие фильтры: S500/20x (возбуждение) и S535/30m (подавление) для ZsYellow; S430/25x (возбуждение) и S470/30m (подавление) для AmCyan. Для КНФ: фильтры S565/55x (возбуждение) и S650/75m (подавление) для dsRed-monomer; и такие же для AmCyan.

 

 

Измерение и анализ информации ( Язык оригинала)

 

 

In crosstalk measurements and DNF evaluation experiments the cells were analyzed on a BD LSRII flow analyzer. ZsYellow was measured using a 488 nm laser and a 530/30 emission filter. AmCyan was measured with a 405 nm laser and a 450/50 emission filter. The data were analyzed using FlowJo software (FlowJo LLC). For each sample, the normalized ZsYellow level was calculated by dividing the compensated mean ZsYellow intensity in AmCyan-positive cells (obtained by putting the threshold at the highest autofluorescence value of AmCyan-negative cells) by the compensated mean AmCyan value in these cells. The normalized values collected in a single experiment were further divided by the ZsYellow/AmCyan ratio in the negative control samples. In the DNF evaluation experiments, the ratios were normalized to the lowest value in the unrepressed group of experiments. The same analyzer was used for the CNF evaluation experiments with LacI repressor. AmCyan was measured with a 405 nm laser and a 525/50 emission filter and dsRed-monomer with a 488 nm laser and a 575/26 emission filter. For each sample, the normalized dsRed level was calculated by dividing the compensated mean dsRed intensity (corrected for the cell autofluorescence) in AmCyan positive cells by the compensated and corrected mean AmCyan values in these cells. These values were divided by similarly calculated values in the negative controls where nonsense siRNA was applied at the same concentration as in the experiments. A MoFlo cell sorter (Darko) was used to analyze the C1 evaluation with LacI-KRAB repressor and the anticorrelated output experiments. ZsYellow was measured with a 488 nm laser and a 530/40 emission filter and dsRed monomer with a 568 nm laser and a 630/30 emission filter. The data from C1 evaluation were processed similarly to those described above. In the anticorrelated output experiment, for each reporter the mean value of its intensity in the transfected cells was weighted by the relative number of transfected cells and these numbers were independently factored for each reporter to the higher of the two values. All reported values (except for the data in Supplementary Fig. 3) are averages of two independent experiments, and at least 30,000 qualified events were collected for each sample.

 

 

Измерение и анализ информации (Технический перевод)

 

 

Для измерение уровня помех и оценивания ДНФ клетки анализировались на BD LSRII анализаторе. ZsYellow измерялся, используя 488 нм лазер и 530/30 эмиссионный фильтр. AmCyan измерялся 405 нм лазером и 450/50 эмиссионным фильтром. Информация измерялась программным обеспечением FlowJo (FlowJo LLC). Для каждого образца нормализованный уровень ZsYellow был рассчитан делением компенсированной средней интенсивности ZsYellow в AmCyan-позитивных клетках на компенсированное автофлуоресцентное среднее значение AmCyan в этих клетках. Нормализованные значения, полученные в результате одного эксперимента, были потом поделены на отношение ZsYellow/AmCyan в негативных контрольных образцах. В экспериментах оценивания ДНФ, отношения были приведены к минимальному значению. Такой же анализатор использовался в экспериментах оценивания КНФ с помощью репрессора LacI. Уровень AmCyan измерялся 405 нм лазером и 525/50 эмиссионным фильтром и dsRed-мономером с 488 нм лазером и 575/26 эмиссионным фильтром. Для каждого образца нормализованный уровень dsRed вычислялся делением