Фазово – контрастный метод

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ г. СЕМЕЙ

Методическое пособие по теме:

Методы исследования структуры

и функций биологических мембран

Составитель: преподаватель Крылова Л.А.

ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕМБРАН.

Оптическая микроскопия.

Наблюдать структуру мембраны в обычный оптический микроскоп нельзя. Чтобы это понять, вспомним, что такое предел разрешения прибора Z. Это минимальное расстояние между двумя точками, изображения которых еще можно увидеть раздельными. Естественно, что чем меньше Z, тем качественнее прибор, так как позволяет видеть более мелкие структуры. Для грубой оценки разрешения оптического микроскопа используем соотношение: .

В качестве для оценки подставим в формулу минимальное значение длины волны видимого света ( ) и получим для предела разрешения Z=200 нм.

Эта величина примерно в 20 раз больше толщины мембраны, поэтому о наблюдении мембраны в оптический микроскоп не может быть и речи. Но возможно использование микропроекции и микрофотографии.

Формирование микроскопического изображения происходит с участием человека и завершается образованием действительного изображения в глазу. Обычный микроскоп сам по себе не создает действительное изображение. Однако для фотографирования (микрофотография) или проекции микроскопического изображения на экран (микропроекция) должно быть получено действительное изображение. Для этого изображении, даваемое объектовом Об, надо расположить дальше фокусного расстояния окуляра Ок (рис. 1).

Рис. 1.

Метод темного поля.

Наиболее распространенным приемом оптической микроскопии является наблюдение фиксированных и окрашенных препаратов в проходящем свете, называемое методом светлого поля(см. рис. 2 а).

В последнее время в практику входят методы микроскопии нефиксированных и неокрашенных объектов. Наблюдение таких объектов в проходящем свете не дает желаемых результатов вследствие отсутствия контраста между элементами структуры объекта, а также между объектом и окружающей средой. В этих случаях используется метод наблюдения в темном поле(см. рис. 2 б), который осуществляется путем применения в обычном биологическом микроскопе особого конденсора. Конденсор темного поля состоит из нескольких линз особой формы, образующих наклонные пучки света, которые освещают препарат. Падая на мелкие элементы структуры объекта, свет рассеивается на них и таким образом частично попадает в объектив. Это делает объект видимым на общем темном поле зрения микроскопа.

Фазово – контрастный метод.

Метод применяется для наблюдения малоконтрастных объектов, он основан на использовании разности фаз, которая образуется при прохождении света через различные структуры исследуемого объекта. Интенсивность световой волны, проходящей через прозрачный объект, почти не изменяется, но фазы претерпевают изменения, зависящие от толщины объекта и его показателя преломления. Прозрачные объекты называются дефазирующими. Увидеть детали таких объектов обычным образом невозможно. В биофизических исследованиях такие объекты иногда окрашивают, однако при этом могут изменяться их свойства и жизнеспособность. На пути светового пучка устанавливается прозрачная среда, в которой имеется прозрачное включение, например, бактерия (рис. 3). Проходящий пучок света разделится на две части, первая часть пройдет через прозрачный объект и линзой сфокусируется на участке Ф фокальной плоскости F (см. рис. 4. а, линия 1). Другая часть будет дифрагировать на неоднородности обекта и соберется линзой в точке А плоскости I (см. рис. 4. а, линия 2). Кривая 3 является результатом дифракции света на бактерии. Разность фаз кривых возникает из-за разных показателей преломления сред.

Глаз в плоскости I не различает волны 1и 2, так как их интенсивности одинаковые, а на различие фаз глаз не реагирует. Необходимо фазовую разность преобразовать в амплитудную. Для этого в плоскости F ставят небольшую круглую фазовую пластинку, изменяющую фазу волны 1 на , то волны 1 и 3 окажутся либо в фазе, либо в противофазе. В этом случае контраст бактерии будет усилен (рис. 4. б).

Фазово-контрастные устройства (пластинки, конденсоры) являются дополнительными устройствами к микроскопу.

Ультрамикроскопия.

Это метод обнаружения частиц, размеры которых лежат за пределами разрешения микроскопа. Микроскопы, работающие по этому методу, называют ультрамикроскопами. В них осуществляется боковое (косое) освещение, благодаря чему субмикроскопические частицы видны как светлые точки на темном фоне.